本期為您推薦浙江大學藥物生物技術研究所所長李永泉教授團隊發表在Journal of Applied Microbiology上的一篇文章：Daptomycin production enhancement by ARTP mutagenesis and fermentation optimization in Streptomyces roseosporus。本研究利用ARTP進行突變，采用耐藥性與顯色性雙報告系統成功篩選了一株高產達托霉素菌株。兩個報告基因的表達水平可以評價dptEp啟動子的強度，dptEp啟動子可以刺激達托霉素生物合成中dptE的表達水平，從而產生更多的達托霉素。本文首次在鏈霉菌中應用雙報告系統和新的補料策略，為鏈霉菌次生代謝物的生物合成提供了新的途徑。
達托霉素(Daptomycin)是一種從玫瑰孢鏈霉菌(Streptomyces rosesporus)培養基中提取的新型環狀脂肽抗生素，由立派制藥公司于1997年成功開發。其商品名立普妥于2003年獲得美國食品和藥物管理局(FDA)批準，用于治療復雜的皮膚感染。2006年，FDA進一步批準其用于治療革蘭氏陽性菌引起的心內膜炎和菌血癥。
目前已有多種策略改造玫瑰孢鏈霉菌來達到高產達托霉素的效果，包括傳統誘變，核糖體工程和基因重組技術，由此得到的工程菌在搖瓶水平產量達到324 mg/L。盡管目前基因工程是提高菌株質量的首選方法，但在許多情況下，隨機誘變仍然是唯一可行的選擇。常壓室溫等離子體(ARTP)誘變是近年來發展起來的一種有效的誘變技術，具有成本低、操作簡便、育種方法有效等優點。利用APTR進行誘變，同時使用報告基因對誘變效率進行篩選的方法尚未在玫瑰孢鏈霉菌中有過研究。
研究人員將野生菌株L2796中引入耐藥性與顯色性雙報告基因，對其進行ARTP誘變。結果表明，當處理時間為150 s時，致死率為80.20%，此時的陽性突變率為8.18%。對突變后的菌株進行耐卡那霉素濃度檢測（圖2），野生菌株表現出對卡那霉素的高敏感性（<50 μg/mL），單輪突變菌株L2796-D對卡那霉素的耐藥性顯著提高（700 μg/mL）。在L2796-D基礎上進行第二輪ARTP誘變，產生的L2796-D-M菌株卡那霉素耐藥性繼續升高（1200 μg/mL），該濃度下的野生菌株與L2796-D生長被完全抑制（圖2a），同時串聯表達的顯色基因結果顯示L2796-D-M比單輪突變菌株L2796-D具有更深的顏色表征，表明在2輪突變后dptEp啟動子強度顯著提升。
研究人員在40個菌株中發現其中的23個菌株中的GusA蛋白活性提高（圖3a），在這23株中有14株的達托霉素產量提高，最高產量達到95 mg/L（圖3b），比原生菌株提高了58.33%，將其命名為L2201。在傳代8代以后，其達托霉素產量沒有出現顯著降低，表明了遺傳的穩定性（圖3c）。在搖瓶水平的基因的表達結果顯示，高產菌株L2201的兩個報告基因表達量相較于出發菌株均有一定的提升，報告基因的表現與達托霉素生物合成基因的表現是相互關聯的（圖4）。后期通過培養基配比與補料策略的優化可以提升L2201的產量達到752.67 mg/L。該方法為研究高產達托霉素菌株的篩選提供新的途徑。
圖1 雙報告系統的建立及本文實驗流程
圖2 突變株卡那霉素抗性試驗及不同菌株 GusA活性分析
圖3 L2796-D-M的GusA活性，達托霉素產量和突變株L2201的遺傳穩定性
圖4 搖瓶培養過程中dptE和Neo基因轉錄水平的變化
論文鏈接：
https://doi.org/10.1093/jambio/lxad230
本期為您推薦浙江大學藥物生物技術研究所所長李永泉教授團隊發表在Journal of Applied Microbiology上的一篇文章：Daptomycin production enhancement by ARTP mutagenesis and fermentation optimization in Streptomyces roseosporus。本研究利用ARTP進行突變，采用耐藥性與顯色性雙報告系統成功篩選了一株高產達托霉素菌株。兩個報告基因的表達水平可以評價dptEp啟動子的強度，dptEp啟動子可以刺激達托霉素生物合成中dptE的表達水平，從而產生更多的達托霉素。本文首次在鏈霉菌中應用雙報告系統和新的補料策略，為鏈霉菌次生代謝物的生物合成提供了新的途徑。
達托霉素(Daptomycin)是一種從玫瑰孢鏈霉菌(Streptomyces rosesporus)培養基中提取的新型環狀脂肽抗生素，由立派制藥公司于1997年成功開發。其商品名立普妥于2003年獲得美國食品和藥物管理局(FDA)批準，用于治療復雜的皮膚感染。2006年，FDA進一步批準其用于治療革蘭氏陽性菌引起的心內膜炎和菌血癥。
目前已有多種策略改造玫瑰孢鏈霉菌來達到高產達托霉素的效果，包括傳統誘變，核糖體工程和基因重組技術，由此得到的工程菌在搖瓶水平產量達到324 mg/L。盡管目前基因工程是提高菌株質量的首選方法，但在許多情況下，隨機誘變仍然是唯一可行的選擇。常壓室溫等離子體(ARTP)誘變是近年來發展起來的一種有效的誘變技術，具有成本低、操作簡便、育種方法有效等優點。利用APTR進行誘變，同時使用報告基因對誘變效率進行篩選的方法尚未在玫瑰孢鏈霉菌中有過研究。
研究人員將野生菌株L2796中引入耐藥性與顯色性雙報告基因，對其進行ARTP誘變。結果表明，當處理時間為150 s時，致死率為80.20%，此時的陽性突變率為8.18%。對突變后的菌株進行耐卡那霉素濃度檢測（圖2），野生菌株表現出對卡那霉素的高敏感性（<50 μg/mL），單輪突變菌株L2796-D對卡那霉素的耐藥性顯著提高（700 μg/mL）。在L2796-D基礎上進行第二輪ARTP誘變，產生的L2796-D-M菌株卡那霉素耐藥性繼續升高（1200 μg/mL），該濃度下的野生菌株與L2796-D生長被完全抑制（圖2a），同時串聯表達的顯色基因結果顯示L2796-D-M比單輪突變菌株L2796-D具有更深的顏色表征，表明在2輪突變后dptEp啟動子強度顯著提升。
研究人員在40個菌株中發現其中的23個菌株中的GusA蛋白活性提高（圖3a），在這23株中有14株的達托霉素產量提高，最高產量達到95 mg/L（圖3b），比原生菌株提高了58.33%，將其命名為L2201。在傳代8代以后，其達托霉素產量沒有出現顯著降低，表明了遺傳的穩定性（圖3c）。在搖瓶水平的基因的表達結果顯示，高產菌株L2201的兩個報告基因表達量相較于出發菌株均有一定的提升，報告基因的表現與達托霉素生物合成基因的表現是相互關聯的（圖4）。后期通過培養基配比與補料策略的優化可以提升L2201的產量達到752.67 mg/L。該方法為研究高產達托霉素菌株的篩選提供新的途徑。
圖1 雙報告系統的建立及本文實驗流程
圖2 突變株卡那霉素抗性試驗及不同菌株 GusA活性分析
圖3 L2796-D-M的GusA活性，達托霉素產量和突變株L2201的遺傳穩定性
圖4 搖瓶培養過程中dptE和Neo基因轉錄水平的變化
論文鏈接：
https://doi.org/10.1093/jambio/lxad230
