引言：
近日，中國(guó)科學(xué)院近代物理研究所胡偉青年研究員團(tuán)隊(duì)與清華大學(xué)化學(xué)工程系張翀教授團(tuán)隊(duì)聯(lián)袂主導(dǎo)的研究成果“ Engineering Bacillus coagulans with high osmotic tolerance for enhancing L-lactic acid production using sweet sorghum juice coupled with acid-pretreated soybean meal under unsterile conditions ”在《 Industrial Crops & Products 》期刊上發(fā)表。
本研究聚焦于凝結(jié)芽孢桿菌在促進(jìn)非食用甜高粱發(fā)酵成高產(chǎn)乳酸上的潛力，使用蘭州重離子研究裝置（HIRFL）構(gòu)建突變體庫(kù)，結(jié)合全自動(dòng)高通量微生物液滴培養(yǎng)系統(tǒng)（Microbial Microdroplet Culture system，MMC）進(jìn)行高通量、自動(dòng)化液滴富集、篩選，最終得到具有高滲透壓耐受性的凝結(jié)芽孢桿菌，與親本菌株相比，其L-乳酸產(chǎn)量顯著提高1倍。此外，該工程菌結(jié)合酸水解豆粕和維生素B (VB)化合物在開(kāi)放式非無(wú)菌條件下單批次發(fā)酵甜高粱汁，23h發(fā)酵可產(chǎn)L-乳酸113.5 g / L，光學(xué)純度高達(dá)99.8%，顯示出更高效的甜高粱高分子級(jí)L-乳酸生物制造潛力。
一、研究背景
1.L-乳酸的市場(chǎng)需求與生產(chǎn)挑戰(zhàn)性
L-乳酸是生物可降解塑料（如聚乳酸）的關(guān)鍵原料，市場(chǎng)需求持續(xù)增長(zhǎng)。
傳統(tǒng)生產(chǎn)依賴糧食基原料（如玉米淀粉），存在與糧食安全沖突、成本高的問(wèn)題。
非糧原料利用（如甜高粱汁、豆粕）成為可持續(xù)生產(chǎn)的研究方向，但存在發(fā)酵效率低、預(yù)處理成本高等瓶頸。
2.非滅菌發(fā)酵的工業(yè)意義
傳統(tǒng)發(fā)酵需嚴(yán)格滅菌，能耗高且設(shè)備復(fù)雜，增加生產(chǎn)成本。
開(kāi)放（非滅菌）發(fā)酵可大幅降低能耗和操作難度，但需解決雜菌污染問(wèn)題，對(duì)菌株耐受性提出更高要求。
3.菌株選擇與滲透壓耐受性缺陷
凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）是理想候選菌（耐酸、高溫發(fā)酵、L-乳酸高產(chǎn)），但其低滲透壓耐受性限制了在非滅菌高糖環(huán)境中的應(yīng)用。
甜高粱汁含高濃度糖分（滲透壓高），易導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)抑制，需通過(guò)基因工程提升菌株適應(yīng)性。
4.原料利用的協(xié)同策略
甜高粱汁：富含可發(fā)酵糖，但碳源單一，需補(bǔ)充氮源。
酸預(yù)處理豆粕：提供低成本氮源，但含抑制性副產(chǎn)物（如鹽離子、酸降解物），進(jìn)一步增加滲透壓壓力。
需開(kāi)發(fā)菌株同時(shí)耐受高滲透壓和抑制物，實(shí)現(xiàn)原料高效共利用。
二、菌株篩選與工程菌株驗(yàn)證
1.菌株篩選
（1） 菌株來(lái)源與預(yù)處理
菌種選擇：使用凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）CICC 23843，培養(yǎng)方法參照Yan等（2024）的文獻(xiàn)。
菌體收集：將細(xì)菌培養(yǎng)至OD??? ≈ 0.96，用30%甘油懸浮保存。
（2） 突變庫(kù)構(gòu)建
重離子誘變：在蘭州重離子研究裝置（HIRFL）中，用12C??離子束輻照處理菌體，誘導(dǎo)基因突變。
初代培養(yǎng)：取100 μL處理后的菌懸液，在42 °C下于MRS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)。
（3） MMC富集
菌體預(yù)處理：用富集培養(yǎng)基洗滌菌體（調(diào)整OD???≈0.13）。
微滴封裝：通過(guò)MMC（天木生物）生成微升級(jí)液滴，將菌體封裝至微滴中（2~3 μL / 微滴，共50個(gè)微滴）。
富集條件：
①溫度：41 °C。
②培養(yǎng)時(shí)間：8小時(shí)/周期。
③循環(huán)操作：每周期將培養(yǎng)好的液滴接種至使用新鮮培養(yǎng)基、新生成的液滴中，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。
（4） 高滲耐受菌株篩選
目標(biāo)微滴分離：選擇OD???值高的微滴，轉(zhuǎn)移至無(wú)菌EP管。
高鹽平板篩選：將菌液涂布于含1 M NaCl的MRS平板，篩選形成大菌落的耐受株。
2.工程菌株驗(yàn)證
（1） 甜高粱汁的預(yù)處理
熱石灰澄清：用氧化鈣（CaO）調(diào)節(jié)甜高粱汁pH至10.0，60 ℃恒溫維持1小時(shí)，離心后取上清液。
中和處理：用磷酸調(diào)節(jié)上清液pH至7.0，繼續(xù)反應(yīng)1小時(shí)后離心。
酸水解：用98%濃硫酸調(diào)節(jié)pH至2.0，90℃水解1小時(shí)，加入40%氫氧化鈣（Ca(OH)?）懸浮液中和至pH 6.8-7.0。
（2） 豆粕的預(yù)處理
酸水解：將160 g干豆粕與800 g 6.25%硫酸溶液混合，90 ℃水解24小時(shí)。
中和處理：加入40%氫氧化鈣（ Ca(OH)? ）懸浮液調(diào)節(jié)pH至6.8-7.0。
（3） 發(fā)酵培養(yǎng)條件
接種準(zhǔn)備：使用40-5007菌株作為種子液，接種量為10%（v/v）。
發(fā)酵參數(shù)：發(fā)酵罐體積：5 L（實(shí)際裝液量2.8 L）。
培養(yǎng)基組成：預(yù)處理后的甜高粱汁+豆粕水解液。
培養(yǎng)條件：溫度：50 ℃；轉(zhuǎn)速：180 rpm；通氣量：0.9 L/min。
三、主要成果
本研究成功建立了一個(gè)基于重離子誘變結(jié)合微滴富集的高效育種平臺(tái)，并構(gòu)建了一株具有高滲透耐受性的L-乳酸高產(chǎn)菌株。使用酸預(yù)處理的豆粕和最佳添加的 VB 化合物，工程菌株在 5 L分批生物反應(yīng)器中轉(zhuǎn)化酸預(yù)處理的甜高粱汁，L-乳酸產(chǎn)量為 113.5 g/L、生產(chǎn)率 4.9 g/L/h，并且在非無(wú)菌條件下產(chǎn)率為95%。該工程菌株有望以非食用甜高粱為原料實(shí)現(xiàn)L-乳酸的高效、低成本生產(chǎn)。
四、研究亮點(diǎn)
1.高滲透壓耐受菌株的創(chuàng)制
重離子誘變+高通量微滴篩選：通過(guò)重離子束誘變結(jié)合自動(dòng)化微滴微流控技術(shù)—MMC，篩選出滲透壓耐受性顯著提升的凝結(jié)芽孢桿菌突變株。與原始菌株相比，突變株在高糖環(huán)境下的L-乳酸產(chǎn)量和耐受性均顯著提高，為甜高粱汁高效轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。
2.營(yíng)養(yǎng)優(yōu)化提升轉(zhuǎn)化效率
維生素B補(bǔ)充：通過(guò)添加維生素B族，進(jìn)一步強(qiáng)化菌株代謝活力，提升糖酸轉(zhuǎn)化率。
酸預(yù)處理豆粕協(xié)同利用：豆粕經(jīng)酸水解后作為低成本氮源，與甜高粱汁（碳源）復(fù)配，提高乳酸產(chǎn)率和生產(chǎn)效率。
3.非滅菌工藝下的高效生產(chǎn)
開(kāi)放發(fā)酵突破：在無(wú)需滅菌的條件下，工程菌單批次發(fā)酵23小時(shí)即產(chǎn)出 113.5 g/L L-乳酸，光學(xué)純度達(dá) 99.8% 。
關(guān)于MMC
關(guān)于我們
天木生物專注于生物育種領(lǐng)域的高端儀器裝備的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用，致力于通過(guò)高效的突變技術(shù)和高通量篩選技術(shù)，改造提升產(chǎn)業(yè)傳統(tǒng)菌種開(kāi)發(fā)模式，為生物制造產(chǎn)業(yè)提質(zhì)增效，提升我國(guó)生物產(chǎn)業(yè)的核心競(jìng)爭(zhēng)力。 致力于為行業(yè)“細(xì)胞和菌種開(kāi)發(fā)與篩選效率低”、“相關(guān)裝備成本昂貴”、“產(chǎn)業(yè)化落地困難”等難題提供優(yōu)秀的解決方案。
引言：
近日，中國(guó)科學(xué)院近代物理研究所胡偉青年研究員團(tuán)隊(duì)與清華大學(xué)化學(xué)工程系張翀教授團(tuán)隊(duì)聯(lián)袂主導(dǎo)的研究成果“ Engineering Bacillus coagulans with high osmotic tolerance for enhancing L-lactic acid production using sweet sorghum juice coupled with acid-pretreated soybean meal under unsterile conditions ”在《 Industrial Crops & Products 》期刊上發(fā)表。
本研究聚焦于凝結(jié)芽孢桿菌在促進(jìn)非食用甜高粱發(fā)酵成高產(chǎn)乳酸上的潛力，使用蘭州重離子研究裝置（HIRFL）構(gòu)建突變體庫(kù)，結(jié)合全自動(dòng)高通量微生物液滴培養(yǎng)系統(tǒng)（Microbial Microdroplet Culture system，MMC）進(jìn)行高通量、自動(dòng)化液滴富集、篩選，最終得到具有高滲透壓耐受性的凝結(jié)芽孢桿菌，與親本菌株相比，其L-乳酸產(chǎn)量顯著提高1倍。此外，該工程菌結(jié)合酸水解豆粕和維生素B (VB)化合物在開(kāi)放式非無(wú)菌條件下單批次發(fā)酵甜高粱汁，23h發(fā)酵可產(chǎn)L-乳酸113.5 g / L，光學(xué)純度高達(dá)99.8%，顯示出更高效的甜高粱高分子級(jí)L-乳酸生物制造潛力。
一、研究背景
1.L-乳酸的市場(chǎng)需求與生產(chǎn)挑戰(zhàn)性
L-乳酸是生物可降解塑料（如聚乳酸）的關(guān)鍵原料，市場(chǎng)需求持續(xù)增長(zhǎng)。
傳統(tǒng)生產(chǎn)依賴糧食基原料（如玉米淀粉），存在與糧食安全沖突、成本高的問(wèn)題。
非糧原料利用（如甜高粱汁、豆粕）成為可持續(xù)生產(chǎn)的研究方向，但存在發(fā)酵效率低、預(yù)處理成本高等瓶頸。
2.非滅菌發(fā)酵的工業(yè)意義
傳統(tǒng)發(fā)酵需嚴(yán)格滅菌，能耗高且設(shè)備復(fù)雜，增加生產(chǎn)成本。
開(kāi)放（非滅菌）發(fā)酵可大幅降低能耗和操作難度，但需解決雜菌污染問(wèn)題，對(duì)菌株耐受性提出更高要求。
3.菌株選擇與滲透壓耐受性缺陷
凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）是理想候選菌（耐酸、高溫發(fā)酵、L-乳酸高產(chǎn)），但其低滲透壓耐受性限制了在非滅菌高糖環(huán)境中的應(yīng)用。
甜高粱汁含高濃度糖分（滲透壓高），易導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)抑制，需通過(guò)基因工程提升菌株適應(yīng)性。
4.原料利用的協(xié)同策略
甜高粱汁：富含可發(fā)酵糖，但碳源單一，需補(bǔ)充氮源。
酸預(yù)處理豆粕：提供低成本氮源，但含抑制性副產(chǎn)物（如鹽離子、酸降解物），進(jìn)一步增加滲透壓壓力。
需開(kāi)發(fā)菌株同時(shí)耐受高滲透壓和抑制物，實(shí)現(xiàn)原料高效共利用。
二、菌株篩選與工程菌株驗(yàn)證
1.菌株篩選
（1） 菌株來(lái)源與預(yù)處理
菌種選擇：使用凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）CICC 23843，培養(yǎng)方法參照Yan等（2024）的文獻(xiàn)。
菌體收集：將細(xì)菌培養(yǎng)至OD??? ≈ 0.96，用30%甘油懸浮保存。
（2） 突變庫(kù)構(gòu)建
重離子誘變：在蘭州重離子研究裝置（HIRFL）中，用12C??離子束輻照處理菌體，誘導(dǎo)基因突變。
初代培養(yǎng)：取100 μL處理后的菌懸液，在42 °C下于MRS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)。
（3） MMC富集
菌體預(yù)處理：用富集培養(yǎng)基洗滌菌體（調(diào)整OD???≈0.13）。
微滴封裝：通過(guò)MMC（天木生物）生成微升級(jí)液滴，將菌體封裝至微滴中（2~3 μL / 微滴，共50個(gè)微滴）。
富集條件：
①溫度：41 °C。
②培養(yǎng)時(shí)間：8小時(shí)/周期。
③循環(huán)操作：每周期將培養(yǎng)好的液滴接種至使用新鮮培養(yǎng)基、新生成的液滴中，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。
（4） 高滲耐受菌株篩選
目標(biāo)微滴分離：選擇OD???值高的微滴，轉(zhuǎn)移至無(wú)菌EP管。
高鹽平板篩選：將菌液涂布于含1 M NaCl的MRS平板，篩選形成大菌落的耐受株。
2.工程菌株驗(yàn)證
（1） 甜高粱汁的預(yù)處理
熱石灰澄清：用氧化鈣（CaO）調(diào)節(jié)甜高粱汁pH至10.0，60 ℃恒溫維持1小時(shí)，離心后取上清液。
中和處理：用磷酸調(diào)節(jié)上清液pH至7.0，繼續(xù)反應(yīng)1小時(shí)后離心。
酸水解：用98%濃硫酸調(diào)節(jié)pH至2.0，90℃水解1小時(shí)，加入40%氫氧化鈣（Ca(OH)?）懸浮液中和至pH 6.8-7.0。
（2） 豆粕的預(yù)處理
酸水解：將160 g干豆粕與800 g 6.25%硫酸溶液混合，90 ℃水解24小時(shí)。
中和處理：加入40%氫氧化鈣（ Ca(OH)? ）懸浮液調(diào)節(jié)pH至6.8-7.0。
（3） 發(fā)酵培養(yǎng)條件
接種準(zhǔn)備：使用40-5007菌株作為種子液，接種量為10%（v/v）。
發(fā)酵參數(shù)：發(fā)酵罐體積：5 L（實(shí)際裝液量2.8 L）。
培養(yǎng)基組成：預(yù)處理后的甜高粱汁+豆粕水解液。
培養(yǎng)條件：溫度：50 ℃；轉(zhuǎn)速：180 rpm；通氣量：0.9 L/min。
三、主要成果
本研究成功建立了一個(gè)基于重離子誘變結(jié)合微滴富集的高效育種平臺(tái)，并構(gòu)建了一株具有高滲透耐受性的L-乳酸高產(chǎn)菌株。使用酸預(yù)處理的豆粕和最佳添加的 VB 化合物，工程菌株在 5 L分批生物反應(yīng)器中轉(zhuǎn)化酸預(yù)處理的甜高粱汁，L-乳酸產(chǎn)量為 113.5 g/L、生產(chǎn)率 4.9 g/L/h，并且在非無(wú)菌條件下產(chǎn)率為95%。該工程菌株有望以非食用甜高粱為原料實(shí)現(xiàn)L-乳酸的高效、低成本生產(chǎn)。
四、研究亮點(diǎn)
1.高滲透壓耐受菌株的創(chuàng)制
重離子誘變+高通量微滴篩選：通過(guò)重離子束誘變結(jié)合自動(dòng)化微滴微流控技術(shù)—MMC，篩選出滲透壓耐受性顯著提升的凝結(jié)芽孢桿菌突變株。與原始菌株相比，突變株在高糖環(huán)境下的L-乳酸產(chǎn)量和耐受性均顯著提高，為甜高粱汁高效轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。
2.營(yíng)養(yǎng)優(yōu)化提升轉(zhuǎn)化效率
維生素B補(bǔ)充：通過(guò)添加維生素B族，進(jìn)一步強(qiáng)化菌株代謝活力，提升糖酸轉(zhuǎn)化率。
酸預(yù)處理豆粕協(xié)同利用：豆粕經(jīng)酸水解后作為低成本氮源，與甜高粱汁（碳源）復(fù)配，提高乳酸產(chǎn)率和生產(chǎn)效率。
3.非滅菌工藝下的高效生產(chǎn)
開(kāi)放發(fā)酵突破：在無(wú)需滅菌的條件下，工程菌單批次發(fā)酵23小時(shí)即產(chǎn)出 113.5 g/L L-乳酸，光學(xué)純度達(dá) 99.8% 。
關(guān)于MMC
關(guān)于我們
天木生物專注于生物育種領(lǐng)域的高端儀器裝備的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用，致力于通過(guò)高效的突變技術(shù)和高通量篩選技術(shù)，改造提升產(chǎn)業(yè)傳統(tǒng)菌種開(kāi)發(fā)模式，為生物制造產(chǎn)業(yè)提質(zhì)增效，提升我國(guó)生物產(chǎn)業(yè)的核心競(jìng)爭(zhēng)力。 致力于為行業(yè)“細(xì)胞和菌種開(kāi)發(fā)與篩選效率低”、“相關(guān)裝備成本昂貴”、“產(chǎn)業(yè)化落地困難”等難題提供優(yōu)秀的解決方案。
