引言：
近日，中國科學院近代物理研究所胡偉青年研究員團隊與清華大學化學工程系張翀教授團隊聯(lián)袂主導的研究成果“ Engineering Bacillus coagulans with high osmotic tolerance for enhancing L-lactic acid production using sweet sorghum juice coupled with acid-pretreated soybean meal under unsterile conditions ”在《 Industrial Crops & Products 》期刊上發(fā)表。
本研究聚焦于凝結(jié)芽孢桿菌在促進非食用甜高粱發(fā)酵成高產(chǎn)乳酸上的潛力，使用蘭州重離子研究裝置（HIRFL）構(gòu)建突變體庫，結(jié)合全自動高通量微生物液滴培養(yǎng)系統(tǒng)（Microbial Microdroplet Culture system，MMC）進行高通量、自動化液滴富集、篩選，最終得到具有高滲透壓耐受性的凝結(jié)芽孢桿菌，與親本菌株相比，其L-乳酸產(chǎn)量顯著提高1倍。此外，該工程菌結(jié)合酸水解豆粕和維生素B (VB)化合物在開放式非無菌條件下單批次發(fā)酵甜高粱汁，23h發(fā)酵可產(chǎn)L-乳酸113.5 g / L，光學純度高達99.8%，顯示出更高效的甜高粱高分子級L-乳酸生物制造潛力。
一、研究背景
1.L-乳酸的市場需求與生產(chǎn)挑戰(zhàn)性
L-乳酸是生物可降解塑料（如聚乳酸）的關(guān)鍵原料，市場需求持續(xù)增長。
傳統(tǒng)生產(chǎn)依賴糧食基原料（如玉米淀粉），存在與糧食安全沖突、成本高的問題。
非糧原料利用（如甜高粱汁、豆粕）成為可持續(xù)生產(chǎn)的研究方向，但存在發(fā)酵效率低、預處理成本高等瓶頸。
2.非滅菌發(fā)酵的工業(yè)意義
傳統(tǒng)發(fā)酵需嚴格滅菌，能耗高且設(shè)備復雜，增加生產(chǎn)成本。
開放（非滅菌）發(fā)酵可大幅降低能耗和操作難度，但需解決雜菌污染問題，對菌株耐受性提出更高要求。
3.菌株選擇與滲透壓耐受性缺陷
凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）是理想候選菌（耐酸、高溫發(fā)酵、L-乳酸高產(chǎn)），但其低滲透壓耐受性限制了在非滅菌高糖環(huán)境中的應(yīng)用。
甜高粱汁含高濃度糖分（滲透壓高），易導致菌體生長抑制，需通過基因工程提升菌株適應(yīng)性。
4.原料利用的協(xié)同策略
?甜高粱汁：富含可發(fā)酵糖，但碳源單一，需補充氮源。
酸預處理豆粕：提供低成本氮源，但含抑制性副產(chǎn)物（如鹽離子、酸降解物），進一步增加滲透壓壓力。
需開發(fā)菌株同時耐受高滲透壓和抑制物，實現(xiàn)原料高效共利用。
二、菌株篩選與工程菌株驗證
1.菌株篩選
（1） 菌株來源與預處理
菌種選擇：使用凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）CICC 23843，培養(yǎng)方法參照Yan等（2024）的文獻。
菌體收集：將細菌培養(yǎng)至OD????≈ 0.96，用30%甘油懸浮保存。
（2） 突變庫構(gòu)建
重離子誘變：在蘭州重離子研究裝置（HIRFL）中，用12C??離子束輻照處理菌體，誘導基因突變。
初代培養(yǎng)：取100 μL處理后的菌懸液，在42 °C下于MRS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時。
（3） MMC富集
菌體預處理：用富集培養(yǎng)基洗滌菌體（調(diào)整OD???≈0.13）。
微滴封裝：通過MMC（天木生物）生成微升級液滴，將菌體封裝至微滴中（2~3 μL / 微滴，共50個微滴）。
富集條件：
①溫度：41 °C。
②培養(yǎng)時間：8小時/周期。
③循環(huán)操作：每周期將培養(yǎng)好的液滴接種至使用新鮮培養(yǎng)基、新生成的液滴中，共進行40個循環(huán)。
（4） 高滲耐受菌株篩選
目標微滴分離：選擇OD???值高的微滴，轉(zhuǎn)移至無菌EP管。
高鹽平板篩選：將菌液涂布于含1 M NaCl的MRS平板，篩選形成大菌落的耐受株。
2.工程菌株驗證
（1） 甜高粱汁的預處理
熱石灰澄清：用氧化鈣（CaO）調(diào)節(jié)甜高粱汁pH至10.0，60 ℃恒溫維持1小時，離心后取上清液。
中和處理：用磷酸調(diào)節(jié)上清液pH至7.0，繼續(xù)反應(yīng)1小時后離心。
酸水解：用98%濃硫酸調(diào)節(jié)pH至2.0，90℃水解1小時，加入40%氫氧化鈣（Ca(OH)?）懸浮液中和至pH 6.8-7.0。
（2） 豆粕的預處理
酸水解：將160 g干豆粕與800 g 6.25%硫酸溶液混合，90 ℃水解24小時。
中和處理：加入40%氫氧化鈣（ Ca(OH)??）懸浮液調(diào)節(jié)pH至6.8-7.0。
（3） 發(fā)酵培養(yǎng)條件
接種準備：使用40-5007菌株作為種子液，接種量為10%（v/v）。
發(fā)酵參數(shù)：發(fā)酵罐體積：5 L（實際裝液量2.8 L）。
培養(yǎng)基組成：預處理后的甜高粱汁+豆粕水解液。
培養(yǎng)條件：溫度：50 ℃；轉(zhuǎn)速：180 rpm；通氣量：0.9 L/min。
三、主要成果
本研究成功建立了一個基于重離子誘變結(jié)合微滴富集的高效育種平臺，并構(gòu)建了一株具有高滲透耐受性的L-乳酸高產(chǎn)菌株。使用酸預處理的豆粕和最佳添加的 VB 化合物，工程菌株在 5 L分批生物反應(yīng)器中轉(zhuǎn)化酸預處理的甜高粱汁，L-乳酸產(chǎn)量為 113.5 g/L、生產(chǎn)率 4.9 g/L/h，并且在非無菌條件下產(chǎn)率為95%。該工程菌株有望以非食用甜高粱為原料實現(xiàn)L-乳酸的高效、低成本生產(chǎn)。
四、研究亮點
1.高滲透壓耐受菌株的創(chuàng)制
重離子誘變+高通量微滴篩選：通過重離子束誘變結(jié)合自動化微滴微流控技術(shù)—MMC，篩選出滲透壓耐受性顯著提升的凝結(jié)芽孢桿菌突變株。與原始菌株相比，突變株在高糖環(huán)境下的L-乳酸產(chǎn)量和耐受性均顯著提高，為甜高粱汁高效轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。
2.營養(yǎng)優(yōu)化提升轉(zhuǎn)化效率
維生素B補充：通過添加維生素B族，進一步強化菌株代謝活力，提升糖酸轉(zhuǎn)化率。
酸預處理豆粕協(xié)同利用：豆粕經(jīng)酸水解后作為低成本氮源，與甜高粱汁（碳源）復配，提高乳酸產(chǎn)率和生產(chǎn)效率。
3.非滅菌工藝下的高效生產(chǎn)
開放發(fā)酵突破：在無需滅菌的條件下，工程菌單批次發(fā)酵23小時即產(chǎn)出 113.5 g/L L-乳酸，光學純度達 99.8% 。
關(guān)于MMC
關(guān)于我們
天木生物專注于生物育種領(lǐng)域的高端儀器裝備的開發(fā)與應(yīng)用，致力于通過高效的突變技術(shù)和高通量篩選技術(shù)，改造提升產(chǎn)業(yè)傳統(tǒng)菌種開發(fā)模式，為生物制造產(chǎn)業(yè)提質(zhì)增效，提升我國生物產(chǎn)業(yè)的核心競爭力。?致力于為行業(yè)“細胞和菌種開發(fā)與篩選效率低”、“相關(guān)裝備成本昂貴”、“產(chǎn)業(yè)化落地困難”等難題提供優(yōu)秀的解決方案。
引言：
近日，中國科學院近代物理研究所胡偉青年研究員團隊與清華大學化學工程系張翀教授團隊聯(lián)袂主導的研究成果“ Engineering Bacillus coagulans with high osmotic tolerance for enhancing L-lactic acid production using sweet sorghum juice coupled with acid-pretreated soybean meal under unsterile conditions ”在《 Industrial Crops & Products 》期刊上發(fā)表。
本研究聚焦于凝結(jié)芽孢桿菌在促進非食用甜高粱發(fā)酵成高產(chǎn)乳酸上的潛力，使用蘭州重離子研究裝置（HIRFL）構(gòu)建突變體庫，結(jié)合全自動高通量微生物液滴培養(yǎng)系統(tǒng)（Microbial Microdroplet Culture system，MMC）進行高通量、自動化液滴富集、篩選，最終得到具有高滲透壓耐受性的凝結(jié)芽孢桿菌，與親本菌株相比，其L-乳酸產(chǎn)量顯著提高1倍。此外，該工程菌結(jié)合酸水解豆粕和維生素B (VB)化合物在開放式非無菌條件下單批次發(fā)酵甜高粱汁，23h發(fā)酵可產(chǎn)L-乳酸113.5 g / L，光學純度高達99.8%，顯示出更高效的甜高粱高分子級L-乳酸生物制造潛力。
一、研究背景
1.L-乳酸的市場需求與生產(chǎn)挑戰(zhàn)性
L-乳酸是生物可降解塑料（如聚乳酸）的關(guān)鍵原料，市場需求持續(xù)增長。
傳統(tǒng)生產(chǎn)依賴糧食基原料（如玉米淀粉），存在與糧食安全沖突、成本高的問題。
非糧原料利用（如甜高粱汁、豆粕）成為可持續(xù)生產(chǎn)的研究方向，但存在發(fā)酵效率低、預處理成本高等瓶頸。
2.非滅菌發(fā)酵的工業(yè)意義
傳統(tǒng)發(fā)酵需嚴格滅菌，能耗高且設(shè)備復雜，增加生產(chǎn)成本。
開放（非滅菌）發(fā)酵可大幅降低能耗和操作難度，但需解決雜菌污染問題，對菌株耐受性提出更高要求。
3.菌株選擇與滲透壓耐受性缺陷
凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）是理想候選菌（耐酸、高溫發(fā)酵、L-乳酸高產(chǎn)），但其低滲透壓耐受性限制了在非滅菌高糖環(huán)境中的應(yīng)用。
甜高粱汁含高濃度糖分（滲透壓高），易導致菌體生長抑制，需通過基因工程提升菌株適應(yīng)性。
4.原料利用的協(xié)同策略
?甜高粱汁：富含可發(fā)酵糖，但碳源單一，需補充氮源。
酸預處理豆粕：提供低成本氮源，但含抑制性副產(chǎn)物（如鹽離子、酸降解物），進一步增加滲透壓壓力。
需開發(fā)菌株同時耐受高滲透壓和抑制物，實現(xiàn)原料高效共利用。
二、菌株篩選與工程菌株驗證
1.菌株篩選
（1） 菌株來源與預處理
菌種選擇：使用凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）CICC 23843，培養(yǎng)方法參照Yan等（2024）的文獻。
菌體收集：將細菌培養(yǎng)至OD????≈ 0.96，用30%甘油懸浮保存。
（2） 突變庫構(gòu)建
重離子誘變：在蘭州重離子研究裝置（HIRFL）中，用12C??離子束輻照處理菌體，誘導基因突變。
初代培養(yǎng)：取100 μL處理后的菌懸液，在42 °C下于MRS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時。
（3） MMC富集
菌體預處理：用富集培養(yǎng)基洗滌菌體（調(diào)整OD???≈0.13）。
微滴封裝：通過MMC（天木生物）生成微升級液滴，將菌體封裝至微滴中（2~3 μL / 微滴，共50個微滴）。
富集條件：
①溫度：41 °C。
②培養(yǎng)時間：8小時/周期。
③循環(huán)操作：每周期將培養(yǎng)好的液滴接種至使用新鮮培養(yǎng)基、新生成的液滴中，共進行40個循環(huán)。
（4） 高滲耐受菌株篩選
目標微滴分離：選擇OD???值高的微滴，轉(zhuǎn)移至無菌EP管。
高鹽平板篩選：將菌液涂布于含1 M NaCl的MRS平板，篩選形成大菌落的耐受株。
2.工程菌株驗證
（1） 甜高粱汁的預處理
熱石灰澄清：用氧化鈣（CaO）調(diào)節(jié)甜高粱汁pH至10.0，60 ℃恒溫維持1小時，離心后取上清液。
中和處理：用磷酸調(diào)節(jié)上清液pH至7.0，繼續(xù)反應(yīng)1小時后離心。
酸水解：用98%濃硫酸調(diào)節(jié)pH至2.0，90℃水解1小時，加入40%氫氧化鈣（Ca(OH)?）懸浮液中和至pH 6.8-7.0。
（2） 豆粕的預處理
酸水解：將160 g干豆粕與800 g 6.25%硫酸溶液混合，90 ℃水解24小時。
中和處理：加入40%氫氧化鈣（ Ca(OH)??）懸浮液調(diào)節(jié)pH至6.8-7.0。
（3） 發(fā)酵培養(yǎng)條件
接種準備：使用40-5007菌株作為種子液，接種量為10%（v/v）。
發(fā)酵參數(shù)：發(fā)酵罐體積：5 L（實際裝液量2.8 L）。
培養(yǎng)基組成：預處理后的甜高粱汁+豆粕水解液。
培養(yǎng)條件：溫度：50 ℃；轉(zhuǎn)速：180 rpm；通氣量：0.9 L/min。
三、主要成果
本研究成功建立了一個基于重離子誘變結(jié)合微滴富集的高效育種平臺，并構(gòu)建了一株具有高滲透耐受性的L-乳酸高產(chǎn)菌株。使用酸預處理的豆粕和最佳添加的 VB 化合物，工程菌株在 5 L分批生物反應(yīng)器中轉(zhuǎn)化酸預處理的甜高粱汁，L-乳酸產(chǎn)量為 113.5 g/L、生產(chǎn)率 4.9 g/L/h，并且在非無菌條件下產(chǎn)率為95%。該工程菌株有望以非食用甜高粱為原料實現(xiàn)L-乳酸的高效、低成本生產(chǎn)。
四、研究亮點
1.高滲透壓耐受菌株的創(chuàng)制
重離子誘變+高通量微滴篩選：通過重離子束誘變結(jié)合自動化微滴微流控技術(shù)—MMC，篩選出滲透壓耐受性顯著提升的凝結(jié)芽孢桿菌突變株。與原始菌株相比，突變株在高糖環(huán)境下的L-乳酸產(chǎn)量和耐受性均顯著提高，為甜高粱汁高效轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。
2.營養(yǎng)優(yōu)化提升轉(zhuǎn)化效率
維生素B補充：通過添加維生素B族，進一步強化菌株代謝活力，提升糖酸轉(zhuǎn)化率。
酸預處理豆粕協(xié)同利用：豆粕經(jīng)酸水解后作為低成本氮源，與甜高粱汁（碳源）復配，提高乳酸產(chǎn)率和生產(chǎn)效率。
3.非滅菌工藝下的高效生產(chǎn)
開放發(fā)酵突破：在無需滅菌的條件下，工程菌單批次發(fā)酵23小時即產(chǎn)出 113.5 g/L L-乳酸，光學純度達 99.8% 。
關(guān)于MMC
關(guān)于我們
天木生物專注于生物育種領(lǐng)域的高端儀器裝備的開發(fā)與應(yīng)用，致力于通過高效的突變技術(shù)和高通量篩選技術(shù)，改造提升產(chǎn)業(yè)傳統(tǒng)菌種開發(fā)模式，為生物制造產(chǎn)業(yè)提質(zhì)增效，提升我國生物產(chǎn)業(yè)的核心競爭力。?致力于為行業(yè)“細胞和菌種開發(fā)與篩選效率低”、“相關(guān)裝備成本昂貴”、“產(chǎn)業(yè)化落地困難”等難題提供優(yōu)秀的解決方案。
